基于STORM成像的高尔基体网络和内体蛋白质分选可视化研究
什么是随机光学重建显微镜STORM？
它有什么应用？
高尔基体转运网络（TGN）和核内体是分泌转运途径中重要的蛋白质分选站。蛋白质分选基本上是一个空间分离的过程，但在哺乳动物细胞中，尚未以高分辨率系统地分析构成分选机制的蛋白质之间的空间关系。在这里，作者借助STORM成像，表明TGN/内涵体定位的货物衔接子AP-1，GGA2和epsinR，在近核高尔基体区域形成长度超过250纳米的伸长结构。作者的数据表明，TGN/内涵体定位的货物衔接子具有明显的空间关系。空间分离的货物衔接子GGA2和AP-1分别调节Frizzled6和Vangl2的分选，并且空间相关的货物衔接子可以协同调节特定的分选过程。
NO.1研究介绍（节选）
在这里，作者利用随机光学重建显微镜（STORM）以高分辨率提供参与TGN/内体分选过程的蛋白质空间分布的更广泛视图。STORM成像在同一照相机帧中同时捕获两种荧光染料以实现20nm的空间分辨率。作者揭示了货物衔接子AP-1和GGA2是空间分离的，它们分别介导平面细胞极性蛋白Vangl2和Frizzled6的分选。超分辨率成像研究显示Frizzled6和Vangl2在空间上与不同的网格蛋白衔接子相关，提供了差异货物分选过程的直接观察。
NO.2研究结果（节选）
1.网格蛋白与TGN/内体定位的货物衔接子的空间关系分析
为了测试STORM是否可以用于比较不同高尔基体定位蛋白之间的空间关系，作者分析了顺式高尔基体标记GM 130和反式高尔基体标记Golgin-97的定位模式。使用常规光学显微镜，GM 130的定位模式与Golgin 97的定位模式没有明显区别（图1A）,相反，用STORM，作者观察到GM 130与Golgin-97的明显分离（图1B，C）。因此，STORM是揭示不同高尔基体定位蛋白质之间空间关系的可行工具。
图1 STORM可用于高分辨率揭示高尔基定位蛋白质的空间关系
（A，B）通过常规荧光显微镜（A）或通过STORM（B）可视化的相同COS7细胞中的顺式高尔基体标记（GM130）和反式高尔基体标记（高尔基体-97）的定位模式。比例尺，500 nm。(C)（B）中所示区域的放大图。比例尺，100 nm。(D)STORM技术揭示了两种不同荧光染料标记的顺式高尔基体标记物（GM130）在COS7细胞中的定位模式。比例尺，500 nm。(E)（D）中所示区域的放大图。比例尺，100 nm。(F)基于从每个实验组中的一个实验获得的四个超分辨率图像，量化GM130和Golgin-97之间以及Alexa Fluor 750标记的GM130和Alexa Fluor 647标记的GM130之间的重叠像素百分比（平均值± SD）。* ** p〈0.001，采用双尾Student t检验。超分辨率图像显示了所指示蛋白在整个核旁区域中的定位模式。图中的每个点代表每个单个细胞的整个近核高尔基区的数据。
使用STORM，作者试图分析COS7细胞中网格蛋白和货物衔接子之间的空间关系。作者选择了大部分货物衔接子位于其中的整个近核高尔基区用于以下超分辨率成像分析。这一分析表明，STORM可以检测到网格蛋白在囊泡外壳周围的环状定位。
图2 近核区货物衔接子与网格蛋白的空间关系分析
(A-G用抗网格蛋白重链和γ 1-adaptin的抗体共染色COS7细胞。应用STORM技术分析了γ 1-adaptin标记的AP-1和网格蛋白重链标记的网格蛋白在COS7细胞中的二维（A-C）和三维（D-G "）定位模式。（A，D）中指示区域的放大图分别显示在（B，C）和（E-G "）中。(H-K）.用epsinR-FLAG转染COS7细胞。转染后第1天，细胞用抗γ 1-adaptin抗体和FLAG标签共染色。STORM分析同一COS7细胞中epsinR-FLAG和网格蛋白重链的空间定位模式。（H）中指定区域的放大图见（I-K "）。(L-O用抗网格蛋白重链和GGA2的抗体共染色COS7细胞。STORM技术分析GGA2和网格蛋白重链在同一COS7细胞中的三维定位模式。（L）中指定区域的放大图见（M-O "）。(P-R)COS7细胞与抗网格蛋白重链和AP3 δ 1的抗体共染色。应用STORM分析AP3 δ 1和网格蛋白重链标记的AP-3在COS7细胞中的二维定位模式。图P中所示区域的放大图显示在（Q，R）中。(S)基于每个实验组3次独立重复采集的超分辨率图像，定量与网格蛋白相关的AP-1、GGA2、AP-3或epsinR斑点组分（平均值± SD，基于≥ 9张超分辨率图像）。超分辨率图像显示了所指示蛋白质在整个近核区域中的定位模式，其中定位了大多数货物衔接子。图中的每个点代表每个单个细胞的整个近核高尔基区的数据。
2.TGN/核内体定位的货物衔接子空间关系分析
接下来，作者以精细分辨率分析了TGN和内体定位的货物衔接子之间的空间关系。
AP-1和epsinR的超分辨率成像分析显示一些epsinR结构与AP-1结构相关（图3E-H，和图3I中的定量）和一些AP-1和epsinR结构彼此分离（图3E，G）。
图3 近核区网格蛋白衔接子的空间关系分析
(A-D，N-Q）COS 7细胞与γ1-adaptin和δ3-adaptin抗体共染色或与γ1-adaptin和GGA 2抗体共染色。然后使用STORM来可视化AP-1和AP-3的定位（A-D）以及AP-1和GGA 2的定位（N-Q）。(E-H，J-M）。用epsinR-FLAG转染COS 7细胞。转染后第1天，用抗γ1-适应素和FLAG标签的抗体（E-H）或抗GGA 2和FLAG标签的抗体（J-M）对细胞进行共染色。然后使用STORM可视化γ1和epsinR-FLAG的定位以及GGA 2和epsinR-FLAG的定位。（A、E、J、N）中指定区域的放大视图如（B-D、F-H、K-M、O-Q）所示。显示了每个面板的比例尺。（I，R）定量与epsinR或AP-3相关的AP-1斑点百分比（I），定量与epsinR或AP-1相关的GGA 2斑点百分比（R）（平均值± SD，基于≥7张超分辨率图像）。***p〈0.001，采用双尾Student t检验。AP-1和AP-3分别用抗γ1和δ3抗体标记。超分辨率图像显示了所指示蛋白质在整个近核区域中的定位模式，其中定位了大多数货物衔接子。图中的每个点代表每个单个细胞的整个近核高尔基区的数据。定量分析基于从每个实验组的三次独立重复获得的超分辨率图像。
3.通过超分辨率成像分析可视化平面细胞极性蛋白Vangl2和Frizzled6在TGN离开时的分选
作者选择了大部分Vangl2定位的近核区域用于超分辨率成像分析。STORM成像分析显示，大多数Vangl2 Y279A、Y280A点状结构不与AP-1相邻（图4J、U）。接下来作者试图用STORM观察这些分选过程。
图4 Vangl2和Frizzled6在通过STORM退出TGN时的分类可视化
(A-H用HA-Vangl2（wt）转染COS7细胞。转染后第1天，将细胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM观察Vangl2（wt）和AP-1 γ亚基在二维（A-D）和三维（E-H "）的定位。（A）中指示区域的放大图见（B-D）。（E）中指示区域的放大图见（F-H）。（F-H）的180 °旋转视图如（F- H）所示。显示了每张图像的比例尺。(I-K)用HA-Vangl2（wt）或HA-Vangl2 Y279A、Y280A或HA-Frizzled6转染COS7细胞。转染后第1天，将细胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM观察Vangl2（wt）和AP-3 δ亚基（I），Vangl2 Y279A、Y280A和AP-1 γ亚基（J），Frizzled6和AP-1 γ亚基（K）的定位。比例尺，500 nm。(L-Q)COS7细胞用HA-Vangl2（L）或HA-Frizzled6（M-P）转染或用epsinR-FLAG和HA-Frizzled6（Q-T）共转染。转染后第1天，将细胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。温育后，使用双色STORM来显现Vangl2和GGA2（L）、Frizzled6和GGA2（M-P）或epsinR-FLAG和Frizzled6（Q）的定位。（M，Q）中指示区域的放大图如（N-P，R-T）所示。(U)与指定货物相关的Vangl2或Frizzled6斑点百分比的定量|适配器（平均值± SD，基于每个实验组≥ 6张超分辨率图像）。* * p〈0.01，*** p〈0.001，采用双尾Student t检验。超分辨率图像显示了所指示蛋白质在整个近核区域中的定位模式，其中定位了大多数货物衔接子。图中的每个点代表每个单个细胞的整个近核高尔基区的数据。定量分析基于从每个实验组的三次独立重复获得的超分辨率图像。(V)所提出的模型显示AP-1、AP-3、epsinR和GGA2在TGN和内体膜上的不同微结构域上组装成具有不同空间关系的伸长结构：空间分离的GGA2和AP-1分别调控Frizzled6和Vangl2的分选;空间相关的货物衔接子GGA2和epsinR共同调节Frizzled6的分选。
NO.3研究讨论（节选）
STORM超高分辨率成像分析也揭示了AP1结构与GGA2结构在很大程度上是分离的，并且至少存在两个epsinR群，一个与AP-1相关，另一个与GGA2相关（图4V）.在酵母中，这些观察结果表明，从酵母到哺乳动物细胞，货物衔接子之间的空间关系是保守的。
总之，STORM超高分辨率成像分析表明，货物衔接子AP-1、AP-3和GGA 2在TGN或核内体的不同出口结构域组装成大的细长结构，以介导特定货物分子的分选（图4V）。空间分离的GGA 2和AP-1分别调节Frizzled 6和Vangl 2的分选。空间相关的货物衔接子GGA 2和epsinR共同调控Frizzled 6的分选。
在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率显微镜来研究高尔基体网络和内体蛋白质分选可视化，目前在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~